PCR-teknologi må ha kunstig syntetiserte rimelige primere og ekstrahert prøve-DNA, og deretter utføre automatisk termisk syklus, og til slutt utføre produktidentifikasjon og analyse. For tiden kan primerdesign og syntese bare utføres i noen få forskningsinstitutter, institutter og klinikker med sterk teknisk styrke. Applikasjonen trenger bare å kjøpe PCR-deteksjonssettet for å starte arbeidet. Det er mange faktorer som påvirker PCR-automatikkens termiske syklus. For forskjellige DNA-prøver er mengden av forskjellige komponenter tilsatt i PCR-reaksjonen og temperatursyklusparametrene inkonsekvente.
Flere hovedpåvirkningsfaktorer introduseres nå som følger.
En, temperatursyklusparametere
I den automatiske termiske PCR-syklusen er den mest kritiske faktoren temperaturen for denaturering og annealing. Som vist i operasjonseksemplet er betingelsene for denaturering, annealing og forlengelse: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, totalt 25~30 A syklus, det amplifiserte fragmentet er 500bp. Her skal tiden for hvert trinn beregnes etter at reaksjonsblandingen når ønsket temperatur. I den automatiske termiske sykluseren tar tiden fra den opprinnelige temperaturen til blandingen til den nødvendige temperaturen 30-60 sekunder. Lengden på denne forsinkelsestiden avhenger av flere faktorer, inkludert type reaksjonsrør, veggtykkelse, volum av reaksjonsblanding, varme kilde (vannbad eller varmeblokk), og temperaturforskjellen mellom de to trinnene, som bør gis tilstrekkelig ved innstilling av termisk syklus Vær oppmerksom på og vurder, og faktisk måling bør utføres på hvert instrument.
En annen viktig betraktning om den termiske syklustiden er avstanden mellom de to primerne; jo lengre avstand, desto lengre tid tar det å syntetisere hele lengden av målsekvensen. Reaksjonstiden gitt ovenfor er basert på den optimale synteselengden på 500 bp. Målsekvensen tegnes opp. Her er en introduksjon til valg av ulike temperaturer.
1. Template-denatureringstemperatur Denatureringstemperaturen bestemmer temperaturen ved hvilken dobbelttrådet DNA smelter i PCR-reaksjonen. Hvis denatureringstemperaturen ikke nås, vil det ikke bli produsert en enkeltstrenget DNA-mal, og PCR vil ikke starte. Lav denatureringstemperatur betyr ufullstendig denaturering, DNA-dobbeltstrenget Det vil renaturere raskt, og dermed redusere utbyttet. Vanligvis 90–95 ℃. Når prøven når denne temperaturen, bør den raskt avkjøles til glødingstemperaturen. DNA-denaturering tar bare noen få sekunder, og det er ikke nødvendig på lang tid; tvert imot bør du prøve ditt beste ved høy temperatur. Forkort den for å opprettholde aktiviteten til Taq DNA-polymerase. Den maksimale denatureringstemperaturen etter tilsetning av Taq DNA-polymerase bør ikke overstige 95°C.
2. Primer-glødetemperatur Glødetemperaturen bestemmer spesifisiteten og utbyttet av PCR; hvis temperaturen er høy, er spesifisiteten sterk, men hvis temperaturen er for høy, kan ikke primeren kombineres fast med malen, og DNA-amplifikasjonseffektiviteten reduseres; temperaturen er lav, utbyttet er høyt, men for lavt kan forårsake primer og mal mismatch , Ikke-spesifikke produkter øker. Vanligvis, start med reaksjonstilstanden på 37 ℃, sett opp en rekke kontrollreaksjoner for å bestemme den optimale glødetemperaturen for en spesifikk reaksjon. Det kan også utledes basert på (G+C)%-innholdet i primerne for å forstå testen. Utgangspunktet for den generelle testen, glødetemperaturen Ta (glødetemperatur) er 5 ℃ lavere enn smeltetemperaturen TTm (smeltetemperatur) til amplifikasjonsprimeren, som kan beregnes i henhold til formelen:
Ta = Tm-5℃= 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Blant dem representerer henholdsvis A, T, G og C antall tilsvarende baser. For en primer på 20 baser, hvis innholdet av (G+C)% er 50%, kan startpunktet for Ta settes til 55°C. Ved en typisk primerkonsentrasjon (som 0,2μmol/L) kan annealingsreaksjonen fullføres i løpet av noen få sekunder, og langvarig annealing er ikke nødvendig.
3. Valget av primerforlengelsestemperatur avhenger av den optimale temperaturen til Taq DNA-polymerase. Vanligvis 70–75 ℃, standardhastigheten for enzymkatalyserte nukleotider ved 72 ℃ kan nå 35–100 nukleotider/sek. per minutt. Lengden på 1kb kan utvides, og hastigheten avhenger av sammensetningen av bufferløsningen, pH-verdien, saltkonsentrasjonen og DNA-malens natur. Hvis det amplifiserte fragmentet er kortere enn 150 bp, kan forlengelsestrinnet utelates, og det blir en dobbel temperatursyklus på grunn av Taq DNA. Polymerasen er tilstrekkelig til å fullføre syntesen av korte sekvenser ved annealingstemperaturen. For korte sekvensfragmenter mellom 100 og 300 bp er det effektivt å bruke en rask og enkel syklus med to temperaturer. På dette tidspunktet er primerforlengelsestemperaturen den samme som glødingstemperaturen. For DNA-fragmenter over 1 kb kan forlengelsestiden kontrolleres innen 1 til 7 minutter i henhold til lengden på fragmentet. Samtidig bør gelatin eller BSA-reagens tilsettes PCR-bufferen for å holde Taq DNA-polymerasen aktiv og stabil i lang tid. Kjønn; 15%-20% glyserol hjelper til med å forsterke ca. 2,5 kb eller lengre DNA-fragmenter.
4. Antallet sykluser med konvensjonell PCR er generelt 25 til 40 sykluser. Den generelle feilen er at antall sykluser er for mye, den uspesifikke bakgrunnen er alvorlig, og kompleksiteten øker. Selvfølgelig er antall sykluser av reaksjonen for lite, og utbyttet er lavt. Derfor er det nødvendig å sikre at produktet oppnås. Under forutsetningen om hastighet, bør antall sykluser minimeres.
Etter at amplifikasjonen er fullført, avkjøles prøven og lagres ved 4°C.
2. Primer Primer Design
For å amplifisere mal-DNA må du først designe to oligonukleotidprimere. De såkalte primerne er faktisk to oligonukleotidfragmenter som er komplementære til mål-DNA-sekvensen som skal amplifiseres. Avstanden mellom de to primerne bestemmer lengden på det amplifiserte fragmentet. , De 5'endene av de to primerne bestemmer posisjonene til de to 5'endene av det amplifiserte produktet. Det kan sees at primerne er nøkkelen til å bestemme lengden, posisjonen og resultatene til de PCR-amplifiserte fragmentene, og primerdesignet er viktigere.
Den nødvendige betingelsen for primerdesign er at mål-DNA-sekvensen som er komplementær til primeren må være kjent. Sekvensen mellom de to primerne er ikke nødvendigvis klar. De to kjente sekvensene er generelt 15-20 baser, som kan syntetiseres med en DNA-syntesemaskin. Tilsvarende to komplementære primere, i tillegg inkluderer prinsippene som generelt følges i primerdesign:
1. Primerlengden beregnes i henhold til statistikk, og sannsynligheten for at en oligonukleotidsekvens på ca. 17 baser kan dukke opp i det humane genomet er én gang. Derfor er primerlengden generelt ikke mindre enn 16 nukleotider, og den høyeste ikke mer enn 30 nukleotider, og den beste lengden er 20-24 nukleotider. Slike korte oligonukleotider vil ikke danne en stabil hybrid ved polymerisasjonstemperaturen (som passerer 72°C). Noen ganger kan det være på 5' Legg til sekvenser som ikke er komplementære til malen på slutten, for eksempel restriksjonsenzymsteder eller promotere, for å fullføre genkloning og andre spesielle behov; primer 5'endebiotinmerke eller fluorescerende merking kan brukes til forskjellige formål som mikrobiell deteksjon.
Noen ganger virker'ikke grunningen, årsaken er ukjent, du kan flytte posisjonen for å løse den.
2. Sammensetningen av (G+C)% innholdsprimere bør være ensartet, og forsøk å unngå å inneholde den samme basispolymeren. (G+C)%-innholdet i de to primerne bør være så likt som mulig, i det kjente amplifiserte fragmentet (G+C) %-innholdet skal være nær fragmentet som skal amplifiseres, generelt 40% til 60% er bedre.
3. Innsiden av primeren bør unngå dannelse av åpenbare sekundære strukturer, spesielt hårnålsstrukturer. For eksempel:
4. Det skal ikke være noen komplementering mellom de to primerne mellom primerne, spesielt ved 3'enden av primeren. Selv om det ikke kan unngås, bør den komplementære basen på 3'enden ikke være større enn 2 baser, ellers er det lett å danne en"primerdimer" Eller"Primer dimer" (Primer dimer). Den såkalte primer-dimeren er i hovedsak et dobbelttrådet DNA-fragment dannet ved forlengelse av en primer på den andre primersekvensen under påvirkning av DNA-polymerase. , Er et vanlig biprodukt av PCR, og blir noen ganger til og med hovedproduktet.
Unngå i tillegg homologe sekvenser mellom de to primerne, spesielt oligonukleotidfragmenter med mer enn 6 påfølgende identiske baser, ellers vil de to primerne konkurrere med hverandre om det samme stedet i malen; på samme måte kan primerne og mål-DNAet som skal amplifiseres. Eller andre sekvenser av prøve-DNAet kan ikke ha homologe sekvenser på mer enn 6 baser. Ellers vil primerne binde seg til andre steder, redusere spesifikk amplifikasjon og øke ikke-spesifikk amplifikasjon.
5. Primer 3'endeparing DNA-polymerase legger til et enkelt nukleotid til 3'enden av primeren. Derfor må paringskravene for 5-6 baser fra 3'enden av primeren og mål-DNA være presise og strenge for å sikre effektiv PCR-amplifikasjon. .
Om primerdesignet er rimelig kan verifiseres ved datamaskinsøk ved hjelp av PCRDESN-programvare og amerikansk PRIMER-programvare.
Kunstig syntetiserte oligonukleotider bør fortrinnsvis renses ved kromatografi (kromatografi) eller PAGE for å fjerne urenheter som korte kjeder som ikke er syntetisert til full lengde. Rensede primere lagret i 25 % acetonitrilløsning ved 4°C kan forhindre mikroorganismer Under normale omstendigheter bør ubrukte primere oppbevares i kjøleskap ved -20°C. Primerne kan lagres i væske i 6 måneder, og kan lagres i 1 til 2 år etter lyofilisering.